专注原料开发 提供优质服务
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T7 RNA聚合酶，精确识别T7启动子区域（5’-TAATACGACTCACTATAG-3）从此区域的G开始，将后续的DNA序列转录成单链RNA。
体外转录的RNA广泛的基础科学和应用技术领域：结构研究、基础RNA生物学、CRISPR、lncRNA、mRNA疫苗和mRNA疗法、siRNA等。各类项目对RNA的纯度有不同需求。
目前T7 RNA聚合酶能有效、快速、高产地提供RNA的体外合成，但有时会出现dsRNA副产物。部分RNA序列在被转录过程中形成局部空间结构，尤其是3'端出现发夹结构容易导致T7 RNA聚合酶以RNA为模板继续延伸，导致dsRNA产生。
RNA 治疗应用中，来自体外合成 RNA 的 dsRNA 污染可以引发先天免疫反应，因为 dsRNA 对多种生理生化的信号通路产生影响，视黄酸诱导基因 (RIG-I)、Toll 样受体 3 (TLR-3) 和蛋白质黑色素瘤分化-相关抗原 5 (MDA5) 。
它可以引起 I 型干扰素的产生，通过激活和上调蛋白激酶 R (PKR) 来抑制翻译，还可以通过激活 2'-5' 寡聚腺苷酸合成酶 (OAS) 酶家族来引起细胞 mRNA 降解。
因此，对体外转录的mRNA，减少dsRNA污染尤其重要。凝胶或色谱纯化方法非常耗时，且不精确，RNA长度越长分离效果会越差，无法纯化精确编码的 RNA。
2019年一篇文献报道一种方法：dsRNA在16%乙醇缓冲液，与纤维素有更强的结合能力，通过J2抗体检测，该方法可以有效去除dsRNA杂质( 1 )。文章介绍此方法在30–1,000 bp范围内的dsRNA能被有效去除，且能高效回收mRNA。
但纯化1K至2kb的mRNA时回收率会降至65-85%，长的mRNA链可能会有自身的局部双链二级结构，在与纤维素结合时可能不利于长链mRNA的回收。对部分本身含有天然双链二级结构的RNA回收不利，且在长链的mRNA回收时可能会造成大量损失。
图1 通过纤维素层析从IVT mRNA中去除长dsRNA
(A图)在1Kb长的m1Ψ mRNA中，掺入0.02–20 ng dsRNA/μg mRNA。使用 0.14 g纤维素的离心柱，纯化100 μg上述含dsRNA杂质的RNA样品。然后，使用J2 dsRNA特异性抗体进行斑点印迹。
(B图) 在1Kb长的m1Ψ mRNA中，掺入0.5–25 ng dsRNA/μg mRNA。分别测试未结合纤维素的mRNA (B图-boud) 经过0.14 g纤维素的离心柱纯化的mRNA (B图-unbound)。再使用J2 dsRNA特异性抗体进行斑点印迹。
2021年一篇文献介绍，一种固定化DNA转录模板，在高盐环境下能有效减少dsRNA的产生(2). 其介绍，增加盐浓度会破坏T7与启动子DNA结合的能力，同时也会抑制T7酶与产物RNA重新结合的稳定性。
在T7酶的N端与模板DNA共价交联下，会在其结合位点附近产生局部高浓度的启动子，即使在高盐环境下也能与T7启动子结合。
而高盐环境下，T7酶转录到RNA的3’端也无法与产物 RNA 重新结合，避免顺式引物延伸活性，大大减少更长的双链 RNA 杂质的产生。
具体方式：在非模板链进行 5'-生物素化，T7酶添加 Strep-tagII肽标签。启动子复合物与Strep-TactinXT包被的磁珠一起孵育，形成图2所示的Tethered体外转录系统。
图2
在该系统下，T7酶能耐受0.1-0.4M的NaCl浓度进行高效的体外转录。
图 3（图A / 图B）
图A和图B：Tethered体外转录系统，T7酶在0.1-0.4M NaCl条件下能有效转录，而unTethered的普通体外转录则会大幅降低转录产量。且Tethered体外转录系统主条带上方的dsRNA比unTethered更少，能有效减少dsRNA产生。该文献介绍的Tethered T7转录系统是减少dsRNA产生，弥补第一篇文献中，纤维素膜方法不利回收天然存在局部双链二级结构RNA的缺陷。但该文献中实验所测试的RNA是24nt的短RNA，未对常规的长链mRNA转录做描述。
两篇文献分别介dsRNA的去除和dsRNA产生避免，具有创新性，为工业化大规模体外转录反应提供宝贵思路。
1331.c.om.银河游戏T7RNA聚合酶
在mRNA药物制备过程中，要减少dsRNA副产物，还需从根源着手，通过更优质的反应体系和优秀的酶在转录反应过程中减少dsRNA副产物。
市面上多种耐热T7 RNA聚合酶通过提高T7的热稳定性，在高温 (42℃-50℃)下进行转录，从而减少dsRNA的生成。这一策略虽有效果却也在工业应用端受限严重；主要问题在于高温转录单个反应产量较低、工业制备mRNA原液时对高温温控更复杂以及多种mRNA制药项目不适用高温反应等。
1331.c.om.银河游戏经多轮筛选，推出可大幅度减少dsRNA产生的T7 RNA Polymerase 3.0，斑点印迹显示dsRNA大幅度少于不同类型竞品T7 RNA Polymerase，且无需50℃反应，37℃反应温度下即可高产、稳定转录出低含量dsRNA的mRNA。
图4 使用J2 dsRNA 特异性抗体对dsRNA标准品进行斑点印迹
图5 斑点免疫印迹测试不同厂家T7转录产物
斑点印迹作为一种dsRNA含量定性检测方法，对比图4与图5可直观看出，1331.c.om.银河T7 RNA Polymerase 3.0能有效降低dsRNA的产生，在等量转录产物中检测到的副产物dsRNA含量远少于常规T7与耐高温T7竞品组，且单个转录体系下1331.c.om.银河T7 RNA Polymerase 3.0与竞品A产量相近（图6）。
图6 不同类型T7 RNA Polymerase转录产量对比
使用双抗体夹心酶联免疫法体对不同类型T7转录产物mRNA原液中dsRNA进行定量检测（图7），1331.c.om.银河T7 RNA Polymerase 3.0转录制备的mRNA中仅检测到0.48μg/mg的dsRNA，已达到IND申检dsRNA残留项的要求（1μg/mg），可以有效减少免疫原性，为mRNA疫苗与药物的研发提供助力（表1）。
图7 双抗体夹心酶联免疫法检测dsRNA标曲
表1 不同类型T7应用体外转录
未来，1331.c.om.银河游戏将持续研发迭代更优质mRNA各类酶原料，努力为mRNA疫苗行业发展提供助力！
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参考文献：
1：A Facile Method for the Removal of dsRNA Contaminant from In Vitro-Transcribed mRNA.Mol Ther Nucleic Acids. 2019 Apr 15; 15: 26–35.doi: 10.1016/j.omtn.2019.02.018
2：High-salt transcription of DNA cotethered with T7 RNA polymerase to beads generates increased yields of highly pure RNA.J Biol Chem. 2021 Sep; 297(3): 100999.doi: 10.1016/j.jbc.2021.100999
